输入决定输出 构建蛋白表达平台
快速阅读: 据《基因工程和生物技术新闻》最新报道，Kemp Proteins公司的米切尔博士强调，开发用于蛋白质表达的细胞系应从蛋白质本身开始，利用机器学习和人工智能优化细胞系。药明生物采用WuXia平台开发抗体片段，ExpreS2ion Biotechnologies公司则使用果蝇S2细胞，展现不同系统的广泛应用。这些技术不仅提高了蛋白质产量，还解决了生产中的关键挑战。
制备用于研究或治疗的蛋白质通常始于细胞系开发。在许多应用中，基因工程被用来优化细胞系以产生高浓度的目标蛋白。研究人员和公司通常从中国仓鼠卵巢（CHO）细胞或人胚肾（HEK）细胞开始，但还有许多其他选择可以考虑。此外，许多新兴工具，特别是基于人工智能的工具，可以改进这一过程。为了了解有关开发用于蛋白质表达的细胞系的最新进展，GEN采访了来自中国、丹麦和美国的三位专家。考虑整个过程“凭借超过30年的经验，我们总是从蛋白质开始，”Kemp Proteins公司的首席科学官米切尔博士说。“蛋白质是最关键的部分，”米切尔说。在选择了蛋白质之后，米切尔和他的同事们应用机器学习（ML）和基于人工智能的工作流程。他说：“通过这些，我们能仅从一级序列中识别出潜在的问题，并且可以分析这些信息来确定该蛋白质将在宿主中何处成熟。”
为了创建一种高效收集这些信息的方法，Kemp Proteins的科学家们开发了一种自动化工作流程，该流程从目标序列开始。然后，这种自动化工作流程会搜索与该序列相关的文献和专利。“我们将所有这些信息提取出来，然后进行机器学习处理，以确定可能存在的翻译后修饰，分泌标签的存在与否，以及蛋白质在宿主中的成熟位置，”米切尔说。“这让我们对蛋白质有了原生的理解。”
Kemp团队随后分析了该序列在重组系统中的表现。“我们不偏向特定的表达系统，”米切尔说。“因此，我们根据产品的特性选择宿主。”为了创建最佳的蛋白质生产程序，科学家们从一开始就思考整个过程。这意味着确定所需的产品特性和关键质量属性。Kemp Proteins的科学家们还考虑了蛋白质将如何使用以及预期的生产规模。它将是一种疗法、疫苗、诊断工具还是研发工具？此外，米切尔和他的同事们确保一个项目能够覆盖所需的任何许可协议费用，并且能够满足里程碑付款。
正如米切尔所说，“这实际上是利用了许多组件来生成具有适当特性的稳定细胞系。”生产用于蛋白质表达的高效细胞系需要一系列步骤，从转染原始宿主细胞到选择和分析最终克隆。如图所示，Kemp Proteins遵循详细的过程来开发用于生产特定蛋白质的最有用和最可靠的细胞系。[未经Kemp Proteins, LLC明确许可，不得复制此图像。]
在过去，这些步骤需要米切尔付出大量的手动劳动。“然后，我开发了一个程序来代替我完成这些工作，”他说。“现在，我只需按下一个按钮，然后喝杯咖啡，回来时就会有一份100到400页的报告，然后我们会根据过去应用的逻辑制定一些策略，以便我们取得成功。”
然而，Kemp的程序源于数十年的经验。“如果你不知道正确的问题，你就可能走向失败，”米切尔说。米切尔在天然产物方面的经验也影响了他表达蛋白质的方式，特别是对于治疗用途。“在我的研究生生涯中，我做了一些结构生物学的研究，以理解蛋白质如何合成天然产物，”他说。“与天然产物一起工作可以帮助你理解不同的可能性。”
例如，米切尔解释说，他的天然产物经验帮助他理解了翻译后修饰和在自然宿主中发生的成熟过程的重要性。“如果有翻译后修饰的需求，那么我们需要选择一个能够执行它的系统，”他说。“如果没有重组宿主能够进行蛋白质的复杂成熟，那么我们就转向自然来源。”此外，使用自然宿主可以避免投资数万美元合成DNA。在这种情况下，米切尔说，宿主已经进化出这种蛋白质，而且没有比自然宿主更合适的了，对吧？不过，他还补充说，即使宿主的地理位置及其生命周期阶段也可能会影响其特定蛋白质的生产。
无论是从自然宿主还是重组宿主生产，产品都需要恰到好处。即使是细微的差别也可能导致重大后果。例如，“在某些糖基化过程中，糖苷中的碳水化合物对于该分子的实际功能非常重要，”米切尔说。
关注片段
虽然完整的抗体因其作为治疗剂而广为人知，但它们也可以从抗体片段中生产，包括抗原结合片段（Fab）、单链可变区（ScFv）区域和重链可变域（VHH）片段。尽管如此，“抗体片段，根据具体设计的不同，可能会遇到几个CMC（化学、生产和控制）挑战，包括但不限于低生产力、聚集和截短、较差的纯化收率和蛋白质稳定性差，”来自中国上海药明生物的细胞系开发部门负责人陈晓月博士说。“较差的可开发性通常是这些问题的根本原因，这可能导致制造期间的高成本问题。”
解决这些挑战依赖于强大的表达系统。“药明生物使用细胞系开发平台WuXia，并采用克隆筛选方法来开发抗体片段，这可以充分利用我们在计算机序列分析和优化工具、宿主细胞系及细胞培养工艺方面的优势。基于超过50个项目，我们平均可获得每升5克的抗体片段滴度。”陈博士说。“稳定池和克隆之间的一致性质量使早期预测产品质量问题成为可能，并能及时从上游/下游过程和分析/制剂支持中进行干预。在上游开发中，药明生物依赖于能够提高滴度并抑制聚集和截短的方法。药明生物在补料分批过程中使用了WuXiUI™平台，或在灌注过程中使用了WuXiUP™平台。该公司还使用了这两种工艺类型的模拟技术。在下游开发中，药明生物采用了优化去除宿主细胞蛋白（HCP）和高通量药代动力学技术的方法。该公司的下游工具箱还包括‘有效的HCP和蛋白酶检测分析方法，实时PAT辅助自动工艺开发和实时产品质量监测，以及经验丰富的配方开发’，陈博士说。这种技术组合可生产出每毫升150毫克的产品。
2024年，药明生物推出了其WuXia293系统，这是一个基于HEK的哺乳动物生产系统。该系统“适合容易发生截短的抗体片段”，同时“在生产力上可与CHO相媲美，显著减少某些对CHO HCP敏感的重组蛋白的截短。”
果蝇的力量
除了使用CHO或HEK细胞系来生产蛋白质外，还可以使用昆虫细胞。例如，果蝇黑腹果蝇S2细胞已经在学术研究中使用了几十年。然而，这些细胞也带来了一些挑战，比如细胞活力低和异质蛋白质的产生。为了改善S2细胞的商业化使用，丹麦霍尔斯姆ExpreS2ion Biotechnologies公司研发和技术高级副总裁索加德博士表示，“我们利用稳定转染的细胞来进行蛋白质表达，与基于杆状病毒的系统相比，在大规模生产中具有显著的成本优势。”
世界各地的公司使用各种细胞系来开发基于蛋白质的治疗药物。在这里，ExpreS2ion Biotechnologies公司的细胞培养总监斯廷·克莱门森博士手持一管浓缩的受体结合域蛋白。尽管许多公司使用哺乳动物细胞系来生产治疗性蛋白质，但ExpreS2ion Biotechnologies公司使用的是果蝇黑腹果蝇S2细胞，展示了这一领域的广泛机会。索加德补充说，他们公司的S2细胞具有很高的活力，并且产生的“同质、正确折叠的蛋白质批次间差异最小”。此外，这些S2细胞可以生长到非常高的密度——通常约为每毫升3000万细胞，有些报告称高达每毫升3.5亿细胞。因此，索加德指出，这些细胞非常适合工业发酵方法，包括分批、补料分批和灌注过程。此外，他指出，这些细胞特别有弹性，天然抗聚集，不需要二氧化碳控制，而且能在室温下生长。
通过基因编辑，ExpreS2ion Biotechnologies公司开发了具有多种糖基化模式的S2细胞系，这些糖基化模式“可以增强疫苗的免疫原性，或者为治疗应用提供更类似人类的糖基化”，索加德说。与拥有NextGen Vaccines和ExpreS2ion Biotechnologies公司的生物技术公司AdaptVac合作，索加德和他的同事们使用S2细胞表达了基于病毒样颗粒的新冠疫苗（ABNCoV2）。在III期临床试验中，该疫苗达到了非劣效性的主要终点，但未能达到针对最新关注变异株的保护力的次要终点。尽管如此，“它的响应持久性远远超过了mRNA疫苗，免疫力持续了一年以上”，索加德说。“据我们所知，这是唯一一款无需佐剂即可提供如此长时间免疫力的新冠疫苗。”
ExpreS2ion Biotechnologies公司现在正在使用类似的技术来开发针对HER2表达癌症的疫苗，目前正开始在欧洲转移性乳腺癌患者中进行首次人体I期安全试验。
从果蝇到人类，公司可以探索一系列细胞系来表达仅用于研究或生物治疗的蛋白质。为了充分利用这些系统，重复一下Kemp Proteins公司的米切尔的建议是有价值的：“总是从蛋白质开始。”
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